狂犬病病毒(RV)ELISA抗体检测试剂盒说明书
兽药名称：狂
通用名称： 狂犬病病毒ELISA抗体检测试剂盒
商品名称： 无
英文名称： Rabies Q Ab ELISA kit
汉语拼音： Kuangquanbingbingdu ELISA Kangti Jianceshijihe
作用与用途
狂犬病是一种致命的人畜共患传染病，该病原是具有高度 神经嗜性的病毒。
狂犬病病毒ELISA抗体检测试剂盒可用于检测家养和野生肉食动物体内的狂犬病毒糖蛋白抗体。该试剂盒可定量，也可定性检测狂犬病病毒抗体滴度，并且比常规方法更加快速、简便。
主要组份与含量
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狂犬病病毒抗原包被板 |
2块板 |
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样品稀释液 |
120mL×1 |
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10倍洗涤液 |
125mL×1 |
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RV HRP标记抗体 |
30mL×1 |
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TMB底物液 |
30mL×1 |
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终止液 |
30mL×1 |
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阳性对照血清标准品 |
0.3mL×1 |
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阳性对照血清WP（0.5EU/ml） |
0.3mL×1 |
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阴性对照血清NC |
0.3mL×1 |
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封板膜 |
2张 |
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说明书 |
1份 |
注意事项
1） 试剂盒储存条件为2-8℃。开启前应确认其批号及有效期。
2） 过期产品请勿使用，不同批号的试剂盒组份禁止混用。
3） 试剂盒使用前各组份试剂均需恢复至室温（25±3℃），使用后放回2-8℃。
4） 应注意避免向试剂盒中引入污染。
5） 实验所用仪器（如：微量移液器，恒温培养箱，ELISA洗板机，酶标仪）需要在使用前进行功能检查，确保其可用性，准确性。
6） 所有试剂严禁接触皮肤和粘膜。检测结束后所用耗材需按国家规定进行无害化处理。
7） 移液器吸头必须一次一换。
8） 未用的微孔板条可装入密封袋中2-8℃保存。
9） 试剂盒中各组份容器只针对该组份使用，不可二次利用。
10） 仅供兽医诊断使用。
用法与判定
1、试剂准备
1) 所有试剂恢复至室温（25±3℃）后使用。
2) 1倍洗涤液的配制 10倍洗涤液使用超纯水进行10倍稀释，稀释后的洗涤液在2-8℃可以稳定保存1周。如配制100mL 1倍洗涤液需10mL 10倍洗涤液加90mL超纯水（dH2O）。
2、阴、阳性对照血清及标准品稀释
按照 “深孔板加样位置示例图” 所示，在A1孔使用样品稀释液100倍稀释阳性对照血清标准品0，即A1孔加入990μL样品稀释液，再加入10μL标准品0，充分混匀命名为标准品1。B1至F1孔再2倍比稀释，分别制作标准品2至标准品6，即先加入500μL样品稀释液，再加入500μL已经稀释好并混匀的上一个标准品。按照示例图所示，在对应位置使用样品稀释液100倍稀释阳性对照血清WP、阴性对照血清NC，即深孔板中每孔加入495μL样品稀释液，然后每孔分别加入5μL WP、NC，充分混匀。
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标准品编号 |
稀释方法 |
标准品浓度 |
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标准品1 |
100倍稀释标准品0 |
4EU/ml |
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标准品2 |
2倍稀释标准品1 |
2EU/ml |
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标准品3 |
2倍稀释标准品2 |
1EU/ml |
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标准品4 |
2倍稀释标准品3 |
0.5EU/ml |
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标准品5 |
2倍稀释标准品4 |
0.25EU/ml |
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标准品6 |
2倍稀释标准品5 |
0.125EU/ml |
3、样品稀释
样品采用100倍稀释。深孔板中每孔加入495μL样品稀释液，然后每孔加入5μL样本，充分混匀。
4、操作步骤
1) 将所有组份从试剂盒中取出，在恒温箱（25±3℃）中放置至少60分钟，恢复至室温。
2) 向包被板中加入100μL深孔板中已稀释好的血清样品。
3) 按照“深孔板加样位置示例图”向包被板指定孔中分别加入100μL稀释后的标准品1-6，WP，和阴性对照血清（NC）。
4) 盖上封板膜，37℃孵育箱中孵育60分钟（±1分钟）。
5) 用ELISA洗板机或微量移液器洗板，弃去孔中液体，每孔加300μL 1 倍洗涤液，洗涤3次。最后一次洗涤后将酶标板在吸水纸上轻轻拍干，严禁各步骤之间孔板出现干燥情况。
6) 每孔加入100μL RV HRP标记抗体。
7) 盖上封板膜，37℃孵育箱中孵育60分钟（±1分钟）。
8) 重复步骤5）。
9) 每孔中加入100μL TMB底物液。
10) 盖上封板膜，25℃下孵育15分钟。
11) 每孔中加入100μL终止液，终止酶促反应。
12) 分别在450nm和620nm（参考波长）处测量吸光度值。若无620nm滤光片，可用630nm滤光片代替。
13) 结果判定与计算。
5、判定
所有孔均使用OD差值进行计算或判定。
OD差值=OD450nm ‒ OD620nm。
若无620nm滤光片，可用630nm滤光片代替。
定性检测
1） 实验成立条件
·阴性对照OD差值的平均值＜0.1；
·WP OD差值的平均值必须为：0.3＜WP＜1.2；
·标准品1 OD差值的平均值必须为：1.5＜Std1＜3.0；
如果检测结果不在规定范围，则需要重新进行检测。
2） 判定标准
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阳性 |
弱阳 |
阴性 |
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X ≥ WP |
Std6 ≤ X ＜ WP |
X ＜ Std6 |
特别提示：X = 待检样品OD差值,
OD差值=OD450nm ‒ OD
定量检测
1） 实验成立条件
·阴性对照OD差值的平均值＜0.1；
·WP OD差值的平均值必须为：0.3＜WP＜1.2；
·标准品OD差值的平均值：标准品1＞标准品2＞标准品3 ＞标准品4＞标准品5＞标准品6；
·0.7＜标准品4 OD差值的平均值 / WP OD差值的平均值＜1.3。
如果检测结果不在规定范围则需要重新进行检测
2）判定标准
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阳性 |
弱阳 |
阴性 |
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Y ≥0.5EU/mL |
0.125EU/ml≤Y＜0.5EU/ml |
Y＜0.125EU/ml |
特别提示：
1） Y = 样品抗体滴度
2） 抗体滴度请使用金诺诊断提供的Excel程序进行计算。请联系供货商索取计算程序。
3） 根据OIE标准，抗体滴度≥0.5EU/mL时，机体具有保护力。
4） 定量检测结果的有效线性范围是0-4EU/ml。当样品检测结果大于4EU/ml时，须将该原始样品经100倍稀释后，继续使用2倍比梯度稀释法检测，取检测结果在0-4EU/ml范围内的数据×倍比稀释倍数，才是准确的抗体滴度。
