改进型口蹄疫病毒O型抗体液相阻断ELISA检测试剂盒
【兽药名称】
通 用 名 改进型口蹄疫病毒O型抗体液相阻断ELISA检测试剂盒
商 品 名 无
英 文 名 Improved Liquid Phase Blocking ELISA Kit for Detecting Antibodies of Foot and Mouth Disease Virus Type O
汉语拼音 Gaijinxing Koutiyi Bingdu O Xing Kangti Yexiangzuduan ELISA Jiance Shijihe
【试剂盒组成】
名 称 |
数 量 |
名 称 |
数 量 |
兔抗包被ELISA板 |
5块 |
25倍PBST浓缩液 |
1瓶(60ml) |
移液槽 |
3个 |
终止液 |
1瓶(30ml) |
口蹄疫O型病毒抗原 |
1~2瓶×6ml |
TMB底物A溶液 |
1瓶(15ml) |
抗原稀释液 |
1瓶(30ml) |
TMB底物B溶液 |
1瓶(15ml) |
口蹄疫O型酶标抗体工作液 |
1瓶(30ml) |
封板膜 |
5张 |
口蹄疫O型阳性对照血清(已稀释浓度为1:8) |
1管(1ml) |
说明书 |
1份 |
口蹄疫阴性对照血清 |
1管(1ml) |
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【试剂工作浓度】
【用 途】 用于检测牛、羊和猪等偶蹄动物血清中口蹄疫O型病毒抗体,适用于动物疫苗免疫抗体定量检测。
【器材准备】
1. 移液器: 10-100µl移液器、30-300 µl移液器、100-1000 µl 移液器各一把。
2. 水质要求:无离子水或蒸馏水均可。
【试剂准备】
磷酸盐-吐温缓冲液(PBST):实验操作前,将本试剂盒配备的25倍PBST浓缩液用无离子水或蒸馏水稀释成1倍PBST(1份浓缩液加入24份水进行稀释),进行洗板和血清的稀释。
【操作步骤】
1.抗原抗体(阴阳性对照血清及待检血清)反应: 根据不同的需要,选择图1-2中的一种布局在酶标板上操作。图1为抗体效价测定(定量)检测10份样品布局图;图2为抗体效价测定(定量)检测20份样品布局图。
1.1稀释血清:以图1为例操作,在酶标板上,以50µl /孔的量用 PBST 2倍连续稀释血清,被检血清在第1~10列从1:4(即A1~A10孔,75µl PBST加25µl被检血清)稀释至1:512;在第11列稀释阳性对照血清,从1:2(即A11孔50µl PBST加50µl阳性对照血清)稀释至1:256;A12~B12孔稀释阴性对照血清,从1:2稀释至1:4;E12~H12孔为病毒抗原对照孔。
图1 96孔酶标板检测10份样品布局图 |
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1 |
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3 |
4 |
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6 |
7 |
8 |
9 |
10 |
11 |
12 |
A |
S1 1:8 |
S2 |
S3 |
S4 |
S5 |
S6 |
S7 |
S8 |
S9 |
S10 |
+1:32 |
- 1:4 |
B |
1:16 |
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1:64 |
1:8 |
C |
1:32 |
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1:128 |
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D |
1:64 |
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1:256 |
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E |
1:128 |
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1:512 |
病毒抗原对照 |
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F |
1:256 |
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1:1024 |
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G |
1:512 |
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1:2048 |
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H |
1:1024 |
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1:4096 |
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图2 96孔酶标板检测20份样品布局图 |
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1 |
2 |
3 |
4 |
5 |
6 |
7 |
8 |
9 |
10 |
11 |
12 |
A |
S1 1:16 |
S2 |
S3 |
S4 |
S5 |
S6 |
S7 |
S8 |
S9 |
S10 |
+1:32 |
- 1:4 |
B |
1:32 |
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1:64 |
1:8 |
C |
1:64 |
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1:128 |
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D |
1:128 |
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1:256 |
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E |
S11 1:16 |
S12 |
S13 |
S14 |
S15 |
S16 |
S17 |
S18 |
S19 |
S20 |
1:512 |
病毒抗原对照 |
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F |
1:32 |
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1:1024 |
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G |
1:64 |
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1:2048 |
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H |
1:128 |
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1:4096 |
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1.2加病毒抗原:将病毒抗原用抗原稀释液稀释至工作浓度,以50µl /孔的量加入到被检血清、阴阳性对照血清的每一稀释孔内,4孔病毒抗原对照孔仅加入100µl /孔稀释至工作浓度的病毒抗原。加入等量的病毒抗原后,血清的稀释度加倍,被检血清从1:8~1:1024,由于阳性对照血清已经预先作了8倍稀释,则变为1:32~1:4096。封板,振荡, 37℃温育30分钟。
2. 用PBST连续洗板3~5次,拍干,按50µl/孔加口蹄疫O型酶标抗体工作液(蓝色),封板,37℃温育30分钟。
3. 用PBST连续洗板3~5次,拍干。将TMB底物A溶液和B溶液以1:1比例混匀,加入混匀后的底物溶液50µL/孔,置37℃显色15分钟。
4. 显色反应结束后,加终止液50µL/孔,终止反应,在酶标仪上读取D450nm值。
【结果判定】
1.试验认可标准
每块板设4孔病毒抗原对照,病毒抗原对照D450nm值应在1.0以上。阳性对照抗体效价应在1:1024±1滴度以内,阴性对照血清抗体效价应<1:8。
2.血清抗体效价的判定
病毒抗原对照4孔,弃去最高和最低D450nm值,计算剩余2孔的平均D450nm值,再除以2,即50%对照值,该值即为临界值,表示阻断50%反应的对照D450nm值。被检血清D450nm值大于临界值的孔为阴性孔,小于等于临界值的孔为阳性孔。若临界值与稀释倍数最高阳性孔的D450nm值相同,则以被检血清阳性孔的最高稀释倍数作为该份血清的抗体效价;若临界值处于两个稀释孔D450nm值之间,抗体效价取相邻阳性孔和阴性孔稀释倍数的反对数中间值,如处于1:64(反对数值为1.8)与1:128(反对数值为2.1)之间,则判定该份血清的抗体效价为1:90(反对数值为1.95),具体判定可见抗体效价计算对照表。
3.结果判定
抗体效价大于或等于1:128判为口蹄疫O型抗体阳性;1:64~1:128时,判为可疑;小于1:64,判定为阴性。可疑血清样品,可以重测,重测抗体效价大于或等于1:128,判为阳性,小于1:128判为阴性。
4. ELISA抗体效价与免疫动物攻毒保护的关系
牛、羊:抗体效价≥1:128,99%以上保护;效价≤1:16,不保护;效价在1:22~90之间,50%保护。
猪:≥1:64,99%以上保护;效价<1:4,不保护;效价在1:4~45,50%保护。
抗体效价计算对照表 |
抗体
效价 |
Log10(效价)
对照计算 |
抗体
效价 |
Log10(效价)
对照计算 |
抗体
效价 |
Log10(效价)
对照计算 |
1:4 |
0.6 |
1:32 |
1.5 |
1:256 |
2.4 |
1:6 |
0.75 |
1:45 |
1.65 |
1:360 |
2.55 |
1:8 |
0.9 |
1:64 |
1.8 |
1:512 |
2.7 |
1:11 |
1.05 |
1:90 |
1.95 |
1:720 |
2.85 |
1:16 |
1.2 |
1:128 |
2.1 |
1:1024 |
3 |
1:22 |
1.35 |
1:180 |
2.25 |
1:1440 |
3.15 |
【注意事项】
1. 为使您的检测获得正确结果,请您在实验前仔细阅读本说明书。
2. 兔抗包被ELISA板,打开真空包装后需尽快用完。
3. 本试剂盒配备的25倍PBST浓缩液在低温放置下,可能有无机盐结晶,用前微热溶化。
4. TMB底物A和B溶液为无色透明液体,应避光保存;底物溶液使用时应现用现配,如出现变色,弃去不用。
5. 根据底物显色情况,可以适当缩短显色时间。
6. 底物显色终止后,尽量在30分钟内进行酶标板读值。
【规 格】 5块ELISA板,已包被兔抗O型口蹄疫病毒抗体,可检测50~100份样品。
【贮 藏】 口蹄疫O型病毒抗原:-20℃以下保存(-40℃以下更稳定);其余试剂盒组分放置4℃保存。
【有 效 期】 6个月。
【生产单位】 兰州兽研生物科技有限公司
仅供兽医诊断使用
附录:试剂盒的溶液配方
1×PBST配方
NaCl 8.0g
KCl 0.2g
KH2PO4 0.2g
Na2HPO4 •12H2O 2.9g
Tween-20 0.5ml
加无离子水至1L,调整pH7.4