猪圆环病毒2型实时荧光PCR检测试剂盒说明书
【产品名称】
通用名称：猪圆环病毒2型实时荧光PCR检测试剂盒
【包装规格】50T/盒
【预期用途】
本试剂盒用于检测猪血清、血浆及组织等样本中的猪圆环病毒2型（PCV2）的DNA，检测结果可用于PCV2感染的辅助诊断。
【检验原理】
1 本试剂盒采用TaqMan探针技术，对PCV2 ORF2基因保守区设计特异性引物和探针，配以相应试剂进行聚合酶链式反应，应用实时荧光定量PCR检测平台，通过荧光信号的变化实现对样品中PCV2 核酸的快速检测。
2 本试剂盒PCR检测体系含有内置参照（内标），通过检测内标是否正常来监测待测样本中是否具有PCR抑制物，避免PCR假阴性。
【主要组成成份】
| 试剂名称 |
规格与装量 |
主要成分 |
| 核酸释放剂 |
250μL /管×1管 |
十二烷基硫酸锂，氯化钠等 |
| PCV2-反应液 |
950μL/管×2管 |
引物、探针、dNTP、Mg2+、PCR缓冲液等 |
| DNA 酶混合液 |
100μL/管×1管 |
热启动Taq酶，UNG酶 |
| PCV2-阳性对照 |
50μL/管×1管 |
PCV2阳性核酸序列 |
| PCV2-阴性对照 |
500μL/管×1管 |
灭菌TE溶液 |
| PCV2-内置对照 |
100μL/管×1管 |
含内置参照序列 |
备注：
1）不同批号产品的成分之间不可以混用或互换。
2）试剂盒内的生物样本均已经灭活处理。
3）自备试验器材：DNase/RNase-free处理的1.5 mL离心管、0.2 mL PCR反应管（8联管或96孔板）；台式离心机；台式震荡混合器；分离器及各种规格的移液器及灭菌吸头（10μL，200μL，1000μL）。
【储存条件及有效期】
试剂应避光密闭储存于-20±5℃；试剂盒有效期为12个月，避免反复冻融。
【适用仪器】
适用于宏石Slan-48P/96P、ABI系列、安捷伦Mx3000P、Bio-rad CFX系列等荧光PCR仪。
【样本要求】
1 适用样本类型：肺、淋巴结、脾脏、肾脏等组织、血清、血浆等。
2 样本处理：
2.1 组织样品处理：取约1g组织病料，于研磨器具中研磨，加入1.2mL生理盐水研磨至匀浆，转移至1.5 mL离心管，8000g离心5分钟，取上清以生理盐水稀释10倍后待用。
2.2 血清或血浆：无需预处理。
2.3 其它样本类型：建议使用商业化病毒核酸提取试剂盒进行DNA的提取和纯化。所提取的核酸建议立即进行检测，否则请于-20℃±5℃冻存，保存时间不超过6个月。
【检验方法】
1 试剂准备（在试剂准备区进行）
1.1 取出包装盒中的各组分（酶除外），室温放置，待其温度平衡至室温，混匀后瞬时离心备用；
1.2 根据待测样本、阴性对照以及阳性对照数量，按比例（PCV2-反应液38μL/头份+DNA 酶混合液2μL/头份+ PCV2-内置参照0.5μL/头份）取相应量的试剂，充分混匀成PCR-Mix，瞬时离心。
1.3 将上述准备好的试剂转移至样本处理区。
2 样本处理及加样（在样本处理区进行）
2.1 向每个反应管中加入5μL核酸释放剂；
2.2 取5μL 阴性对照、阳性对照和已经处理的待测样本，分别加入对应PCR反应孔，静置10min；
2.3 向上述每个反应管中分别加入40μL PCR-Mix，盖上管盖，短暂离心，转移至扩增区。
3 PCR扩增（在扩增与分析区进行，请参照各仪器使用说明书进行设置）
3.1 将PCR反应管放入扩增仪样品槽，按对应顺序设置阴性对照、阳性对照以及待测样本名称。
3.2 仪器参数设置：1）选择FAM通道检测PCV2；2）选择HEX通道检测内置参照；3）请勿选择ROX参比荧光；4）设置反应体系为50μL。
3.3 循环参数设定
|
步骤 |
温度 |
时间 |
循环数 |
| 1 |
逆转录 |
50℃ |
30分钟 |
1 |
| 2 |
cDNA预变性 |
95℃ |
2分钟 |
1 |
| 3 |
变性 |
95℃ |
15秒 |
40 |
| 4 |
退火，延伸及荧光采集 |
60℃ |
30秒 |
40 |
| 5 |
仪器冷却 |
25℃ |
10 秒 |
1 |
设置完毕，保存文件，运行反应程序。
4 结果分析（请参照各仪器使用说明书进行设置）
4.1 反应结束后自动保存结果，仪器将对结果进行自动分析，给出Ct值。注意查看结果的扩增曲线的形状，存在Ct值的结果需呈S型曲线。
4.2 用户也可根据实际情况自行调整，基线起点值可以在3~15、基线终点值可设在5~20，调整阴性对照的扩增曲线使其平直或低于阈值线，使各项参数符合下述“5 质量控制”中的要求。
5 质量控制
5.1 PCV2-阴性对照：FAM通道无Ct值显示或典型的S型扩增曲线，且HEX通道Ct值≤35；
5.2 PCV2-阳性对照：FAM通道Ct值≤30，且扩增曲线为典型的S型；
5.3 以上要求需在同一次实验中同时满足，否则，本次实验无效，需重新进行。
【检验结果的解释】
1 测定FAM 通道Ct值≤35，且扩增曲线为典型的S型，报告为PCV2核酸阳性；
2 测定FAM通道35＜Ct值≤40，判定可疑。应重复检测一次，如检测无Ct值，报告为PCV2核酸阴性，反之报告为阳性。
3 测定FAM 通道无Ct值或典型的S型扩增曲线，同时HEX通道Ct值≤35，报告为PCV2核酸阴性；
4 测定FAM 通道无Ct值或典型的S型扩增曲线，同时HEX通道Ct值＞35或无显示，则该样本的检测结果无效，应查找并排除原因，并对此样本进行重复检测。
【检测方法的局限性】
1 试剂运输，保存不当或试剂配制不准确，可能导致试剂检测性能下降，出现假阴性或定量不准确的结果；
2 如果样本处理时没有控制好交叉污染，可能出现假阳性结果；
3 阳性对照、扩增产物泄漏，可能导致假阳性结果；
4 病原体流行毒株发生变异，可能导致假阴性结果；
5 不同核酸提取方法存在提取效率差异，可能导致假阴性结果。
【产品性能指标】
1 本试剂盒检测企业工作参考品，阴、阳性符合率均为100%；
2 精密度试验表明：批内和批间重复性好，检测结果Ct值的变异系数均<3%；
3 最低检测限：500 copies/mL；
4 特异性试验表明与感染部位相同或感染症状相似的其他病原无交叉反应。
【注意事项】
1 本试剂盒检测结果仅做诊断辅助，使用前请仔细阅读本说明书。
2 实验前请熟悉和掌握需使用的各种仪器的操作方法和注意事项，对每次实验进行质量控制。
3 实验室管理应严格按照PCR基因扩增实验室的管理规范，实验人员必须进行专业培训，实验过程严格分区进行，所用消耗品应灭菌后一次性使用，实验操作的每个阶段使用专用的仪器和设备，各区各阶段用品不能交叉使用。
4 所有的试剂在使用前，均需在室温下充分融化、混匀后使用。
【生产企业】
企业名称：湖南国测生物科技有限公司
生产地址：长沙市宁乡高新区湖南省大学科技产业园1栋
公司网址：www.xnfyzr.com 邮 编：410000
电 话：0731-89516668 传 真： 0731-89516669 |
