猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪伪狂犬病毒、猪瘟病毒和猪圆环病毒2型实时荧光RT-PCR联检试剂盒说明书
【产品名称】
通用名称：猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪伪狂犬病毒、猪瘟病毒和猪圆环病毒2型实时荧光RT-PCR联检试剂盒
【包装规格】50T/盒
【预期用途】
本试剂盒采用探针法实时荧光RT-PCR 技术，用于检测疑似感染猪血液、分泌物及病料组织样本中的猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）、猪伪狂犬病毒（PRV）、猪瘟病毒（CSFV）、猪圆环病毒2型（PCV2）的DNA或RNA，检测结果可用于临床中上述病毒感染的辅助诊断。
【检验原理】
本试剂盒采用Taqman探针技术，对PRRSV、PRV、CSFV、PCV2基因组的保守区分别设计探针引物并标记不同荧光基团，配以高效的反应液进行RT-PCR，应用实时荧光PCR检测平台，通过荧光信号的变化实现样本中PRRSV、PRV、CSFV、PCV2的快速检测。
【主要组成成份】
| 试剂名称 |
规格与装量 |
主要成分 |
| PRRSV-PRV-CSFV-PCV2反应液 |
1075μL/管×2管 |
引物、探针、dNTP、Mg2+、PCR缓冲液等 |
| RNA 酶混合液 |
100μL/管×1管 |
反转录酶、热启动Taq酶等 |
| PRRSV-PRV-CSFV-PCV2阳性对照 |
50μL/管×1管 |
含PRRSV、PRV、CSFV、PCV2保守位点阳性核酸序列 |
| PRRSV-PRV-CSFV-PCV2阴性对照 |
500μL/管×1管 |
灭菌TE溶液 | 备注：
1）不同批号产品的成分之间不可以混用或互换。
2）试剂盒内的生物样本均已经灭活处理。
3）自备试验器材：DNase/RNase-free处理的1.5 mL离心管、0.2 mL PCR反应管（8联管或96孔板）；台式离心机；台式震荡混合器；分离器及各种规格的移液器及灭菌吸头（10μL，200μL，1000μL）。
【储存条件及有效期】
试剂应避光密闭储存于-20±5℃；试剂盒有效期为12个月，避免反复冻融。
【适用仪器】
适用于宏石Slan-48P/96P、ABI系列、安捷伦Mx3000P、Bio-rad CFX系列等荧光PCR仪。
【样本要求】
1 适用样本类型：血液、分泌物、拭子及病料组织样本经提取纯化后的核酸。
2 样本处理：建议使用商业化的试剂盒提取样本中的RNA。所提取的核酸建议立即进行检测，否则请于-20℃±5℃冻存，保存时间不超过6个月。
【检验方法】
1 试剂准备（在试剂准备区进行）
1.1 取出包装盒中的各组分（酶除外），室温放置，待其温度平衡至室温，混匀后瞬时离心备用；
1.2根据待测样本、阴性对照以及阳性对照数量，按比例（PRRSV-PRV-CSFV-PCV2反应液43μL/测试+RNA 酶混合液2μL/测试）取相应量的试剂，充分混匀成PCR-Mix，瞬时离心后备用。
1.3 将上述准备好的试剂转移至样本处理区，待用。
2样本处理及加样 （在样本处理区进行）
2.1 根据待测样本、阴性对照、阳性对照的数量准备反应管，向每个反应管加入45μL PCR-Mix。
2.2 取经处理的待测样本核酸、或阴性对照、或阳性对照各5μL加入对应反应管，盖好管盖，转移至扩增区。
3 PCR扩增（在扩增与分析区进行，请参照各仪器使用说明书进行设置）
3.1将PCR反应管放入扩增仪，按对应顺序设置阴性对照、阳性对照以及待测样本名称。
3.2 荧光检测通道选择:1）选择FAM通道检测PRRSV核酸；2）选择HEX通道检测PRV核酸；3）选择ROX通道检测CSFV核酸；4）选择CY5通道检测PCV2核酸；5）设置反应体系为50μL。
3.3 循环参数设定：
|
步骤 |
温度 |
时间 |
循环数 |
| 1 |
逆转录 |
50℃ |
30分钟 |
1 |
| 2 |
cDNA预变性 |
95℃ |
2分钟 |
1 |
| 3 |
变性 |
95℃ |
15秒 |
40 |
| 4 |
退火，延伸及荧光采集 |
60℃ |
30秒 |
40 |
| 5 |
仪器冷却 |
25℃ |
10 秒 |
1 |
设置完毕，保存文件，运行反应程序。
4 结果分析（请参照各仪器使用说明书进行设置）
4.1 反应结束后自动保存结果，仪器将对结果进行自动分析，给出Ct值。注意查看结果的扩增曲线的形状，存在Ct值的结果需呈S型曲线。
4.2 用户也可根据实际情况自行调整，基线起点值可以在3~15、基线终点值可设在5~20，调整阴性对照的扩增曲线使其平直或低于阈值线，使各项参数符合下述“5 质量控制”中的要求。
5 质量控制
5.1 PRRSV-PRV-CSFV-PCV2 阴性对照：FAM通道、HEX通道、ROX通道和CY5通道均无Ct值显示或典型扩增曲线；
5.2 PRRSV-PRV-CSFV-PCV2 阳性对照：FAM通道、HEX通道、ROX通道和CY5通道Ct值≤30，且具有典型扩增曲线；
5.3 以上要求需在同一次实验中同时满足，否则，本次实验无效，需重新进行。
【检验结果的解释】
1 对于测定FAM 通道Ct值≤35且扩增曲线为典型的S型，报告为PRRSV核酸检测阳性；FAM通道35＜Ct值≤40，报告可疑；FAM通道无Ct值显示或典型扩增曲线，报告PRRSV核酸检测阴性。
2 对于测定HEX通道Ct值≤38且扩增曲线为典型的S型，报告为PRV核酸检测阳性；HEX通道38＜Ct值≤40，报告可疑；HEX通道无Ct值显示或典型扩增曲线，报告PRV核酸检测阴性。
3 对于测定ROX 通道Ct值≤35且扩增曲线为典型的S型，报告为CSFV核酸检测阳性；ROX通道35＜Ct值≤40，报告可疑；ROX通道无Ct值显示或典型扩增曲线，报告CSFV核酸检测阴性。
4 对于测定Cy5 通道Ct值≤38且扩增曲线为典型的S型，报告为PCV2核酸检测阳性；Cy5通道38＜Ct值≤40，报告可疑；Cy5通道无Ct值显示或典型扩增曲线，报告PCV2核酸检测阴性。
5 初次检测判定可疑的结果应进行一次重复检测，如无Ct值显示，则报告该通道对应病原核酸阴性，反之则报告阳性。
【检测方法的局限性】
1 试剂运输，保存不当或试剂配制不准确，可能导致试剂检测性能下降，出现假阴性或定量不准确的结果。
2 如果样本处理时没有控制好交叉污染，可能出现假阳性结果；
3 阳性对照、扩增产物泄漏，可能导致假阳性结果；
4 病原体流行毒株发生变异，可能导致假阴性结果；
5 不同核酸提取方法存在提取效率差异，可能导致假阴性结果。
【产品性能指标】
本试剂盒检测企业工作参考品，阴、阳性符合率均为100%；精密度试验表明：批内和批间重复性好，检测结果Ct值的变异系数均<3%。与感染部位相同或感染症状相似的其他病毒无交叉反应。
【注意事项】
1 本试剂盒检测结果仅做诊断辅助，使用前请仔细阅读本说明书。
2 实验前请熟悉和掌握需使用的各种仪器的操作方法和注意事项，对每次实验进行质量控制。
3 实验室管理应严格按照PCR基因扩增实验室的管理规范，实验人员必须进行专业培训，实验过程严格分区进行，所用消耗品应灭菌后一次性使用，实验操作的每个阶段使用专用的仪器和设备，各区各阶段用品不能交叉使用。
4 所有的试剂在使用前，均需在室温下充分融化、混匀后使用。
【生产企业】
企业名称：湖南国测生物科技有限公司
生产地址：长沙市宁乡高新区湖南省大学科技产业园1栋
公司网址：www.xnfyzr.com 邮 编：410000
电 话：0731-89516668 传 真： 0731-89516669 |
