猪瘟野毒株和兔化弱毒疫苗株实时荧光RT-PCR 检测试剂盒说明书
【产品名称】
通用名称：猪瘟野毒株和兔化弱毒疫苗株实时荧光RT-PCR 检测试剂盒
【包装规格】50T/盒
【预期用途】
本试剂盒采用探针法实时荧光RT-PCR 技术，用于检测猪扁桃体、淋巴结、结肠、脾脏、肾脏、血液、病毒培养物等样本中的猪瘟病毒（CSFV）的 RNA， 检测结果可用于CSFV 感染的辅助诊断，并区分野毒株和疫苗株。
【检验原理】
1针对CSFV 基因组的保守区域设计特异性引物和荧光探针，探针标记FAM 荧光基团，针对兔化弱毒疫苗株基因组特异位点设计引物和探针，探针标记为HEX 荧光基团，配以RT-PCR 反应液，在荧光定量PCR 仪上，应用实时荧光RT-PCR 检测技术，通过荧光信号的变化实现CSFV 的快速检测及鉴别野毒株和疫苗株。
2本试剂盒PCR 检测体系含有内置参照（内标），通过检测内标是否正常来监测待测样本中是否具有PCR 抑制物，避免PCR 假阴性。
【主要组成成份】
| 试剂名称 |
规格与装量 |
主要成分 |
| CSFV-反应液 |
1075μL/管×2 管 |
引物、探针、dNTP、Mg2+、PCR 缓冲液等 |
| RNA 酶混合液 |
100μL/管×1管 |
反转录酶、热启动Taq聚合酶等 |
| CSFV-阳性对照 |
50μL/管×1管 |
CSFV野毒株和疫苗株阳性核酸序列 |
| CSFV-阴性对照 |
500μL/管×1管 |
灭菌TE溶液 |
| CSFV-内置参照 |
100μL/管×1管 |
含内标序列 |
备注：
1）不同批号产品的成分之间不可以混用或互换。
2）试剂盒内的生物样本均已经灭活处理。
3）自备试验器材：DNase/RNase-free 处理的 1.5 mL 离心管、0.2 mL PCR 反应管（8 联管或 96 孔板）；台式离心机；台式震荡混合器；分离器及各种规格的移液器及灭菌吸头（10μL，200μL，1000μL）。
【储存条件及有效期】
试剂盒应避光密闭储存于-20±5℃；试剂盒有效期为 12 个月，避免反复冻融。
【适用仪器】
适用于宏石Slan-48P/96P、ABI 系列、安捷伦Mx3000P、Bio-rad CFX 系列等荧光PCR 仪。
【样本要求】
1适用样本类型：扁桃体、淋巴结、结肠、脾脏、肾脏、血液、病毒培养物等 样本，经提取纯化后的核酸。
2样本处理：建议使用商业化的试剂盒提取样本中的 RNA。所提取的 RNA 建议立即进行检测，否则请于-20℃±5℃冻存，保存时间不超过 6 个月。
【检验方法】
1试剂准备（在试剂准备区进行）
1.1取出包装盒中的各组分（酶除外），室温放置，待其温度平衡至室温，混匀后瞬时离心备用；
1.2根据待测样本、阴性对照以及阳性对照数量，按比例（CSFV-反应液 43μL/ 测试+RNA 酶混合液 2μL/测试+CSFV-内置参照0.5μL/测试）取相应量的试剂， 充分混匀成PCR-Mix，瞬时离心后备用。
1.3将上述准备好的试剂转移至样本处理区，待用。
2样本处理及加样 （在样本处理区进行）
2.1根据待测样本、阴性对照、阳性对照的数量准备反应管，向每个反应管 中加入 45μL PCR-Mix。
2.2分别吸取已处理的样本RNA、阴性对照、阳性对照各 5μL 加入对应反应管，盖好管盖，转移到扩增区。
3PCR 扩增（在扩增与分析区进行，请参照各仪器使用说明书进行设置）
3.1将PCR 反应管放入扩增仪，按对应顺序设置阴性对照、阳性对照以及待测样本名称。
3.2荧光检测通道选择：1）选择FAM通道检测CSFV；2）选择HEX或VIC通 道检测CSFV疫苗株；3）选择ROX通道检测内标；4）设置反应体系为50μL。
3.3循环参数设定：
|
步骤 |
温度 |
时间 |
循环数 |
| 1 |
逆转录 |
50℃ |
30分钟 |
1 |
| 2 |
cDNA预变性 |
95℃ |
2分钟 |
1 |
| 3 |
变性 |
95℃ |
15秒 |
40 |
| 4 |
退火，延伸及荧光采集 |
60℃ |
30秒 |
40 |
| 5 |
仪器冷却 |
25℃ |
10 秒 |
1 |
设置完毕，保存文件，运行反应程序。
4结果分析（请参照各仪器使用说明书进行设置）
4.1反应结束后自动保存结果，仪器将对结果进行自动分析，给出Ct 值。注意查看结果的扩增曲线的形状，存在Ct 值的结果需呈S 型曲线。
4.2用户也可根据实际情况自行调整，基线起点值可以在 3~15、基线终点值可设在 5~20，调整阴性对照的扩增曲线使其平直或低于阈值线，使各项参数符合下述“5 质量控制”中的要求。
5质量控制
5.1CSFV-阴性对照：FAM通道和HEX通道均无Ct值显示或典型的S型扩增曲 线，且ROX通道Ct值≤35；
5.2CSFV-阳性对照：FAM通道和HEX通道Ct值均≤30，且均具有典型的S型扩 增曲线；
5.3以上要求需在同一次实验中同时满足，否则，本次实验无效，需重新进行。
【检验结果的解释】
1测定FAM 通道Ct 值≤35 且具有典型扩增曲线，判定CSFV 阳性；测定 FAM 通道 35＜Ct 值≤40，检测结果可疑，需进行重复检测，复检若无Ct 值，则判定CSFV 阴性，反之判定阳性。
2在上述“1”判定CSFV 阳性基础上，若HEX 通道Ct 值≤35 且具有典型扩增曲线，则进一步判定为兔化弱毒疫苗株。
3在上述“1”判定CSFV 阳性基础上，若HEX 通道无Ct 值显示或典型扩增曲线，则进一步判定为野毒株。
4在上述“1”判定CSFV 阳性基础上，若HEX 通道 35＜Ct 值≤40，检测结果可疑，需进行重复检测，复检若无Ct 值显示，则判定为野毒株，反之判定为兔化弱毒疫苗株。
5测定FAM 通道无Ct 值显示或典型扩增曲线，且ROX 通道Ct 值≤35，判定CSFV 阴性，如 ROX 通道Ct 值＞35 或无显示，则该样本的检测结果无效， 应查找并排除原因，并对此样本进行重复实验。
【检测方法的局限性】
1试剂运输，保存不当或试剂配制不准确，可能导致试剂检测性能下降，出 现假阴性或定量不准确的结果；
2如果样本处理时没有控制好交叉污染，可能出现假阳性结果；
3阳性对照、扩增产物泄漏，可能导致假阳性结果；
4病原体流行毒株发生变异，可能导致假阴性结果；
5不同核酸提取方法存在提取效率差异，可能导致假阴性结果。
【产品性能指标】
1本试剂盒检测企业工作参考品，阴、阳性符合率均为 100%；
2精密度试验表明：批内和批间重复性好，检测结果 Ct 值的变异系数均<3%；
3特异性试验表明与感染部位相同或感染症状相似的其他病原无交叉反应。
【注意事项】
1本试剂盒检测结果仅做诊断辅助，使用前请仔细阅读本说明书。
2实验前请熟悉和掌握需使用的各种仪器的操作方法和注意事项，对每次实 验进行质量控制。
3实验室管理应严格按照PCR 基因扩增实验室的管理规范，实验人员必须进行专业培训，实验过程严格分区进行，所用消耗品应灭菌后一次性使用， 实验操作的每个阶段使用专用的仪器和设备，各区各阶段用品不能交叉使用。
4所有的试剂在使用前，均需在室温下充分融化、混匀后使用。
【生产企业】
企业名称：湖南国测生物科技有限公司
生产地址：长沙市宁乡高新区湖南省大学科技产业园 1 栋
公司网址：www.xnfyzr.com 邮 编：410000
电 话：0731-89516668 传 真： 0731-89516669 |
