猪细小病毒实时荧光PCR检测试剂盒说明书
【产品名称】
通用名称：猪细小病毒实时荧光PCR检测试剂盒
【包装规格】50T/盒
【预期用途】
本试剂盒采用探针法实时荧光PCR技术，用于检测猪血液、病料组织样本中的细小病毒（PPV）的DNA，检测结果可用于PPV感染的辅助诊断。
【检验原理】
1 本试剂盒含有PPV特异的引物及探针（标记FAM荧光基团），配以高效PCR反应液，在荧光定量PCR仪上，利用探针法荧光PCR技术实现对PPV的快速精准检测。
2 PCR检测体系含有内置参照（内标），通过检测内标是否正常来监测待测样本中是否具有PCR抑制物，避免PCR假阴性。
【试剂盒组成】
| 试剂名称 |
规格与装量 |
主要成分 |
| PPV-反应液 |
950 μL/管×2管 |
引物、探针、dNTP、Mg2+、PCR缓冲液等 |
| DNA酶混合液 |
100 μL/管×1管 |
热启动Taq酶等 |
| PPV-阴性对照 |
500 μL/管×1管 |
灭菌TE溶液 |
| PPV-阳性对照 |
50 μL/管×1管 |
含有PPV目标序列 |
| PPV-内置参照 |
100 μL/管×1管 |
含内标模板序列 |
| 核酸释放剂 |
250 μL/管×1管 |
氢氧化钠，十二烷基硫酸锂，氯化钠等 |
备注：
1）不同批号产品的成分之间不可以混用或互换。
2）试剂盒内的生物样本均已经灭活处理。
3）自备试验器材：DNase/RNase-free处理的1.5 mL离心管、0.2 mL PCR反应管（8联管或96孔板）；台式离心机；台式震荡混合器；分离器及各种规格的移液器及灭菌吸头（10μL，200μL，1000μL）。
【储存条件及有效期】
试剂应避光密闭储存于-20±5℃条件；试剂盒有效期为12个月，避免反复冻融。
【适用仪器】
适用于宏石Slan-48P/96P、ABI系列、安捷伦Mx3000P、Bio-rad CFX系列等荧光PCR仪。
【样本要求】
1 适用样本类型：疑似病猪实质器官组织、肠系膜淋巴结，流产胎儿的组织，血清等样品。
2 样本处理：
2.1 组织样品处理：取约1g组织病料，于研磨器具中研磨，加入1.2mL生理盐水研磨至匀浆，转移至1.5 mL离心管，8000g离心5分钟，取上清以生理盐水稀释10倍后待用。
2.2 血清或血浆：无需预处理。
2.3 其它样本类型：建议使用商业化病毒核酸提取试剂盒进行DNA的提取和纯化。所提取的核酸建议立即进行检测，否则请于-20℃±5℃冻存，保存时间不超过6个月。
【检验方法】
1扩增体系的配制（在试剂准备区进行）
1.1 取出包装盒中的各组分（酶除外），室温放置，待其温度平衡至室温，混匀后瞬时离心备用；
1.2 根据待测样本、阴性对照以及阳性对照数量，按比例（PPV-反应液 38μL/测试+DNA 酶混合液2μL/测试+PPV-内置参照0.5μL/测试）取相应量的试剂，加入离心管中，充分混匀成PCR混合液，瞬时离心备用。
1.3 将上述准备好的试剂转移至样本处理区，待用。
2样本处理及加样（在样本处理区进行）
1.1 向每个反应管中加入5μL核酸释放剂；
1.2 取5μL 阴性对照、阳性对照和已经处理的待测样本，分别加入对应PCR反应孔，静置反应10min；
1.3 向每个反应管中分别加入40μL步骤1中的 PCR混合液，盖上管盖，短暂离心，转移至扩增区。
3 PCR扩增（在扩增与分析区进行，请参照各仪器使用说明书进行设置）
3.1 将PCR管放入扩增仪，按对应顺序设置阴性对照、阳性对照及待测样本名称。
3.2 仪器参数设置：1）选择Fam通道检测PPV的DNA；2）选择HEX（或VIC）通道检测内置参照。3）设置反应体系为50μL。
3.3 循环参数设定：
|
步骤 |
温度 |
时间 |
循环数 |
| 1 |
逆转录 |
50℃ |
30分钟 |
1 |
| 2 |
cDNA预变性 |
95℃ |
2分钟 |
1 |
| 3 |
变性 |
95℃ |
15秒 |
40 |
| 4 |
退火，延伸及荧光采集 |
60℃ |
30秒 |
40 |
| 5 |
仪器冷却 |
25℃ |
10 秒 |
1 |
设置完毕，保存文件，运行程序。
4结果分析（请参照各仪器说明进行设置）
4.1 反应结束后自动保存结果，仪器将对结果自动分析，给出Ct值。注意查看结果扩增曲线应呈S形；
4.2 用户可根据实际情况进行调整，基线起点值可以在3-15，终点值在5-20，调整阴性对照的扩增曲线使其平直或低于阈值，使各项参数符合“5 质量控制”中的要求。
5质量控制
5.1 PPV-阴性对照：FAM通道无Ct值显示或典型扩增曲线，HEX通道Ct值≤35；
5.2 PPV-阳性对照：FAM通道Ct值≤30，且扩增曲线为典型的S型；
5.3 上述要求需同时满足，否则，实验结果无效，需重新进行。
【检测结果的解释】
1 测定FAM 通道Ct值≤35，且扩增曲线为典型的S型，报告为PPV核酸检测阳性；
2 测定FAM通道35＜Ct值≤40，判定可疑。应重复检测一次，如检测无Ct值，报告为PPV核酸检测阴性，反之报告为阳性。
3 测定FAM 通道无Ct值或典型的S型扩增曲线，同时HEX通道Ct值≤35，报告为PPV核酸检测阴性；
4 测定FAM 通道无Ct值或典型的S型扩增曲线，同时HEX通道Ct值＞35或无显示，则该样本的检测结果无效，应查找并排除原因，并对此样本进行重复检测。
【检测方法的局限性】
1 试剂运输，保存不当或试剂配制不准确，可能导致试剂检测性能下降，出现假阴性或定量不准确的结果；
2 如果样本处理时没有控制好交叉污染，可能出现假阳性结果；
3 阳性对照、扩增产物泄漏，可能导致假阳性结果；
4 病原体流行毒株发生变异，可能导致假阴性结果；
5 不同核酸提取方法存在提取效率差异，可能导致假阴性结果。
【产品性能指标】
1 本试剂盒检测企业工作参考品，阴、阳性符合率均为100%；
2 精密度试验表明：批内和批间重复性好，检测结果Ct值的变异系数均<3%；
3 最低检测限：500 copies/mL；
4 特异性试验表明与感染部位相同或感染症状相似的其他病原无交叉反应。
【注意事项】
1本试剂盒检测结果仅做诊断辅助，使用前请仔细阅读本说明书。
2实验前请熟悉和掌握需使用的各种仪器的操作方法和注意事项，对每次实验进行质量控制。
3 实验室管理应严格按照PCR基因扩增实验室的管理规范，实验人员必须进行专业培训，实验过程严格分区进行，所用消耗品应灭菌后一次性使用，实验操作的每个阶段使用专用的仪器和设备，各区各阶段用品不能交叉使用。
4 所有的试剂在使用前，均需在室温下充分融化、混匀后使用。
【生产企业】
企业名称：湖南国测生物科技有限公司
生产地址：长沙市宁乡高新区湖南省大学科技产业园1栋
公司网址：www.xnfyzr.com 邮 编：410000
电 话：0731-89516668 传 真： 0731-89516669 |
