猪繁殖与呼吸综合征病毒北美型经典株和高致病性变异株实时荧光RT-PCR检测试剂盒说明书

【产品名称】猪繁殖与呼吸综合征病毒北美型经典株和高致病性变异株实时荧光RT-PCR检测试剂盒

【包装规格】50T/盒

【预期用途】本试剂盒采用实时荧光RT-PCR技术用于检测猪血清、血浆及组织等样本中猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）北美型经典株和高致病性变异株RNA核酸，检测结果可用于PRRSV）北美型经典株和高致病性变异株感染的辅助诊断和鉴别诊断。

【检验原理】1试剂盒针对PRRSV北美型经典株和高致病变异株的nsp2基因的序列差异设计特异性引物和荧光探针，探针标记HEX荧光基团，同时针对PRRSV基因组n基因保守区设计PRRSV北美型通用引物和荧光探针，探针标记FAM荧光基团，配以RTPCR反应液，在荧光定呈PCR仪上,应用实时荧光RTPCR检测技术，通过荧光信号的变化实现PRRSV北美型经典株和高致病变异株RNA的快速检测和鉴别.
2本试剂盒PCR检测体系含有内置参照(内标),通过检测内标是否正常来监测待测样本中是否具有PCR抑制物，避免PCR假阴性.

【主要组成成分】

PRRSV-反应液	1075μL/管*2管	引物、探针、dNTP/Mg2+、PCR缓冲液等
RNA酶混合液	100μL/管*1管	反转录酶、热启动Taq聚合酶等
PRRSV-阳性对照	50μL/管*1管	PRRSV北美性和变异株阳性核酸序列
PRRSV-阴性对照	500μL/管*1管	灭菌TE溶液
PRRSV-内置参照	100μL/管*1管	含内置参照序列

备注：1、不同批号产品的成分之间不可以混用或互换。

2、试剂盒内的生物样本均已经灭活处理。

3、自备实验器材：DN ase/RNase-free处理的1.5毫升离心管、0.2毫升PCR反应管（8联管或96孔板）；台式离心机；台式震荡混合器，分离器及各种规格的移液器及灭菌吸头（10μL、200μL、1000μL）。

【储存条件及有效期】试剂应避光密闭储存于-20℃—5℃，试剂盒有效期为12个月，避免反复冻融。

【适用仪器】适用于宏石Slan-48P/96P、ABI系列、安捷伦Mx3000p、Bio-rad CFX等系列荧光PCR仪。

【样本要求】1.适用样本类型：肺、脾、肾、扁桃体、淋巴结、唾液和血浆等阉割版经提取纯化后的核酸。

2.样本处理：建议使用商业化的试剂盒提取样本中的RNA，所提取的RNA建议立即进行检测，否则请于-20℃±5℃冻存，保存时间不超过6个月。。

【检验方法】1、试剂准备（在试剂准备区进行）

1.1取出包装盒中除酶的各组分，室温放置，待其温度平衡至温室后。混匀后瞬时离心备用。

1.2根据待测样本、阴性对照以及阳性对照数呈,按比例(RRSV-反应液43yL/测试+RNA酶混合液2uL/测试+ PRRSV_内置参照0.5正/测试)取相应呈的试剂，充分混匀成PCR-Mix,瞬时离心后备用.

1.3将上述准各好的试剂转移至样本处理区，待用.

2样本处理及加样(在样本处理区进行)

2.1根据待测样本、阴性对照、阳性对照的数量准备反应管，向每个反应管加入45uL PCR-Mix.

2.2分别吸取已处理的样本RNA.阴性对照、阳性对照各5uL加入对应反应管，盖好管盖，转移到扩增区.

3 PCR扩增(在扩增与分析区进行,请参照各仪器使用说明书进行设置)

3.1将PCR反应管放入扩增仪，按对应顺序设置阴性对照、阳性对照以及待测样本名称.

3.2荧光检测通遵选择:1)选择FAM通遵检测PRRSV北美型; 2)选择HEX或VIC通道检测PRRSV高致病变异株；3）选择ROX通道检测内置参照；4）设置反应体系为50 μL。

	步骤	温度	时间	循环数
1	逆转录	50℃	30分钟	1
2	cDNA预变性	95℃	2分钟	1
3	变性	95℃	15秒	40
4	退火，延伸及荧光采集	60℃	30秒	40
5	仪器冷却	25℃	10 秒	1

4 结果分析（请参照各仪器使用说明书进行设置）
4.1 反应结束后自动保存结果，仪器将对结果进行自动分析，给出Ct值。注意查看结果的扩增曲线的形状，存在Ct值的结果需呈S型曲线。
4.2 用户也可根据实际情况自行调整，基线起点值可以在3~15、基线终点值可设在5~20，调整阴性对照的扩增曲线使其平直或低于阈值线，使各项参数符合下述“5 质量控制”中的要求。 
5 质量控制
5.1 PRRSV-阴性对照：FAM通道和HEX通道均无Ct值显示或典型的S型扩增曲线，且ROX通道Ct值≤35；
5.2 PRRSV-阳性对照：FAM通道和HEX通道Ct值均≤30，且扩增曲线均为典型的S型；
5.3 以上要求需在同一次实验中同时满足，否则，本次实验无效，需重新进行。
【检验结果的解释】
1 测定FAM通道Ct值≤35且具有典型扩增曲线，判定PRRSV北美型核酸阳性；测定FAM通道35＜Ct值≤40，检测结果可疑，需进行重复检测，复检若无Ct值显示，则判定PRRSV北美型核酸阴性，反之判定阳性。
2 测定FAM通道无Ct值显示，且ROX通道Ct值≤35，判定PRRSV北美型核酸阴性，若ROX通道Ct值＞35或无显示，则该样本的检测结果无效，应查找并排除原因，并对此样本进行重复实验。
3 在上述“1”判定PRRSV北美型阳性基础上，若HEX通道Ct值≤35且具有典型扩增曲线，则进一步判定为高致病性变异株。
4 在上述“1”判定PRRSV北美型阳性基础上，若HEX通道无Ct值显示，则进一步判定为经典株。
5 在上述“1”判定PRRSV北美型阳性基础上，若HEX通道35＜Ct值≤40，检测结果可疑，需进行重复检测。复检HEX通道若无Ct值显示，则判定为经典株，反之判定为高致病性变异株。

【检测方法的局限性】
1 试剂运输，保存不当或试剂配制不准确，可能导致试剂检测性能下降，出现假阴性或定量不准确的结果；
2 如果样本处理时没有控制好交叉污染，可能出现假阳性结果；
3 阳性对照、扩增产物泄漏，可能导致假阳性结果；
4 病原体流行毒株发生变异，可能导致假阴性结果；
5 不同核酸提取方法存在提取效率差异，可能导致假阴性结果。
【产品性能指标】
1 本试剂盒检测企业工作参考品，阴、阳性符合率均为100%；
2 精密度试验表明：批内和批间重复性好，检测结果Ct值的变异系数均<3%；
3 特异性试验表明与感染部位相同或感染症状相似的其他病原无交叉反应。