禽流感病毒H7亚型(H7-Re2株)血凝抑制试验兽用抗原、阳性血清与阴性血清说明书
仅供兽医诊断使用
[兽药名称]
通用名称:禽流感病毒H7亚型(H7-Re2株)血凝抑制试验抗原、阳性血清与阴性血清
商品名称:无
英文名称:Avian Influenza VirusH7 Subtype (Strain H7-Re2) Hemagglutination Inhibition Test Antigen, Positive
Sera and Negative Sera
汉语拼音:Qinliuganbingdu H7 Yaxing (H7-Re2 zhu) Xueningyizhishiyan Kangyuan, Yangxingxueqing Yu
Yinxingxueqing
[主要成分与含量]
抗原为灭活的H7亚型禽流感病毒(H7-Re2株)，血凝(HA)效价不低于1:128。测定鸡血清时，使用鸡禽流感病毒H7亚型(H7-Re2株)阳性血清，血凝抑制(H)抗体效价不低于1:128;使用鸡禽流感病毒H7亚型阴性血清，HI|抗体效价不高于1 : 4。测定鸭血清时，使用鸭禽流感病毒H7亚型(H7-Re2株)阳性血清，HI抗体效价不低于1 : 160;使用鸭禽流感病毒H7亚型阴性血清，HI抗体效价不高于1:10。测定鹅血清时，使用鹅禽流感病毒H7亚型(H7-Re2株)阳性血清，HI抗体效价不低于1:160;使用鹅禽流感病毒H7亚型阴性血清，HIl抗体效价不高于1:10。
[性状]
抗原为白色或淡黄色海绵状疏松团块;阳性血清和阴性血清为微黄色或淡红色海绵状疏松团块。易于与瓶壁脱离，加稀释液后迅速溶解。
[作用与用途]
用于HI试验检测禽流感病毒H7亚型(H7-Re2株)抗体。
[用法与判定]
1材料
1 96孔V型(90度)微量反应板、单道及多道微量移液器(配有吸头)、加样槽、吸管、烧杯等。
1.2 pH值7.0~7.2, 0.01mol/L的PBS按照如下方 法配制或购买商品化产品，PBS - -经使用,于2~8°C保存不超过3周。PBS配制方法:秤量NaCl 80g、KCl 2g、十二水磷酸氢二钠36.3g、磷酸二氢钾2.4g, 溶解于ddH20中，并定容至10L用氢氧化钠或盐酸调pH值至7.0~7.2,最后1219C灭菌30分钟或过滤后使用。
1.3 阿氏(Alsevers)液称葡 萄糖2.05g、柠檬酸钠0.8g、柠檬酸0.055g、氯化钠0.42g,加蒸馏水至100ml,加热溶解后调pH值至6.1, 69Kpa 15min高压灭菌，2~8°C保存备用。
1.4 1%鸡红细胞悬液采取2~4只 2~6月龄SPF鸡的血液，与等量阿氏液混合，然后用PBS (0.01mol/L, pH值7.0~7.2,下同)洗涤3~4次，每次以1500r/min离心5~10分钟，将沉积的红细胞用PBS配制成1%悬液。
1.5抗原溶解冻干的抗原和血清均按瓶签规格标注的量，用PBS溶解。
2操作术式
2.1血凝(HA)试验
2.1.1在V型微量反应板中，每孔加0.025ml PBS。
2.1.2第1孔加0.025ml抗原，反复抽打3~5次混匀。
2.1.3从第1孔吸取0.025ml抗原加入第2孔，混匀后吸取0.025ml加入第3孔，如此进行2倍系列稀释至第11孔，从第11孔吸取0.025ml弃去。
2.1.4每孔加0.025ml PBS。
2.1.5每孔加入0.025ml 1% (V/V)鸡红细胞悬液。
2.1.6结果判定将反应板在振荡器上震荡1~2分钟或轻扣反应板混合反应物，置室温20~30分钟或置2~8°C 45~60分钟，当对照孔的红细胞呈显著纽扣状时判定结果。以使红细胞完全凝集的最高稀释度作为判定终点。
2.2血凝抑制(HI)试验(鸭、鹅血清在检测时需要进行前处理,参考方法见注意事项)
2.2.1根据HA试验测定的效价，如果抗原凝集价测定结果为1 : 1024 (举例)，4个血凝单位(即4 HAU)=1024/4=256(即1 : 256)。取PBS 9.0ml,加抗原1.0ml,即成1 : 10稀释，将1 : 10稀释液1.0ml加入到24.6 ml PBS中,使最终浓度为1 : 256。
2.2.2四个单位血凝单位检测检查4HAU的血凝价是否准确,应将配制的1:256稀释液进行系列稀释，使最终稀释
度为1: 2、1:3.1: 4、1 : 5、1 : 6和1 : 7。然后，从每- -稀释度中取0.025ml,加入PBS 0.025ml,再加入1% 鸡红细胞悬液0.025ml,混匀。将血凝板置室温20~40分钟或置2~8°C 40~60分钟,如果配制的抗原液为4HAU,则1 : 4稀释度将给出凝集终点;如果4 HAU高于4个单位，可能1 : 5或1 : 6为终点;如果较低，可能1:2或1:3为终点。应根据检验结果将抗原稀释度做适当调整,使工作液确为4HAU。
2.2.3第2~ 11孔加入0.025ml PBS,第12孔加入0.05ml PBS。
2.2.4第1~2孔加入0.025m血清 ;第2孔血清与PBS充分混匀后吸0.025ml于第3孔，依次2倍系列稀释至第10孔，从第10孔吸取0.025ml弃去。
2.2.5第1~11孔均加入0.025ml的4HAU抗原， 在室温(20~25°C)下静置至少20分钟或2~8°C至少60分钟。2.2.6每孔加入0.025ml 1% (V/N)的鸡红细胞悬液，震荡混匀，在室温(20~25°C)下静置20~40分钟或2~8°C40~60分钟，对照孔红细胞呈显著纽扣状时判定结果。
3结果判定以完全抑制4HAU抗原的最高血清稀释倍数判为该血清的HI抗体效价。测定鸡血清时，当阳性对照血清的HI抗体效价与已知抗体效价误差不超过1个滴度，阴性对照血清抗体效价不高于1 : 4时，试验方可成立;被检血清HI抗体效价不高于1:8判为阴性,不低于1:16判为阳性。检测鸭和鹅血清时,当阳性对照血清的HI抗体效价与已知抗体效价误差不超过1个滴度,阴性对照血清抗体效价不高于1:10时，试验方可成立;被检血清HI抗体效价不高于1 : 10判为阴性,高于1 : 10(不含1 : 10)判为阳性。
[注意事项]
(1)HA和HI试验影响因素甚多，应严格控制试验条件。每加一试剂或样品后需更换吸头，同时应严格控制作用温度和时间。
(2)准确配制红细胞悬液，使用时应随时振摇。
(3)用pH值7.0~7.2的PBS (0.01mol/L)作为稀释液。
(4)抗原和阴、阳性血清若有污染，应废弃。
(5)准确配制4HAU抗原，使用前需进行滴定，滴定好的抗原应在2小时内用完。
(6)抗原和血清按规定保存。冻干试剂应按规定的体积用PBS溶解。溶解后2~8°C保存不超过1个月。
(7)同一亚型不同毒株的HI试验抗原，若抗原性存在差异，则检测同一-血清的HI抗体效价不同。
(8)鸭、鹅血清一般需进行非特异性凝集抑制素的处理，并分别以鸭、鹅阳性血清、阴性血清作为HI试验对照血清。处理参考如下方法，可根据本实验室实际情况选择使用。
①胰酶加热高碘酸盐法
A.取0.3ml血清,加0.15m胰酶溶液(8 mg/ml:200mg的P-250胰酶溶解于25ml的0.01mol/L, pH值7.0~7.2的PBS中，混匀,过滤除菌,分装并在一15°C以下保存， 保存期6个月)，混匀后，在56°C水浴灭活30分钟后冷却至室温。
B.再加入0.9ml高碘酸钾(将230mg的KI04用0.01mol/L, pH 7.0~7.2的PBS, 定容至100ml,过滤除菌后避光室温保存，保存期1周)，混合，室温孵育15分钟。
C.再加入0.9ml的丙三醇盐溶液(1ml的丙三醇加入到99ml的0.01mol/L, pH值7.0~7.2的PBS中，混匀，过滤除菌，室温保存) ,混合，室温孵育15分钟。
D.最后加入0.75ml生理盐水，混匀，置4°C保存备用。处理后的血清最终为10倍稀释的血清。
②受体破坏酶(RDE)处理法
A.1体积血清(50μ) ,加4体积RDE (200μD) ,37°C水浴18小时(过夜)。
B.再加入5体积(250μl)的1.5%浓度的柠檬酸钠，混匀，置56°C水浴30分钟(以破坏残余的RDE活性)。
C.将1体积的50%的红细胞加入到10体积RDE处理的血清中(50μl红细胞+500ul血清),震荡混匀后4°C放置1小时，期间可轻轻摇匀悬浮红细胞数次。
D.1000g离心10分钟,小心吸取上层上清，用于检测。处理后的血清最终为10倍稀释的血清。
[规格] (1) 1ml/瓶(2)2ml/瓶
[包装] (1) 10瓶/盒(2)24盒/箱 (3) 60盒/箱
[贮藏与有效期]一15°C以下保存，有效期为24个月。
[批准文号]兽药临字080018863
[生产企业]哈尔滨维科生物技术有限公司
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